Introduction à la PCR et à la qPCR

La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une technique moléculaire permettant de détecter la présence ou l'absence d’un fragment d’ADN, donnant une réponse qualitative (oui/non). La qPCR (quantitative PCR ou PCR en temps réel) permet quant à elle de quantifier précisément la quantité d’ADN ou d’ARNm présents dans un échantillon, sans recours à un gel d’agarose.

La qPCR est utilisée pour analyser à la fois l’ADN génomique (ADNg) et l’ARN messager (ARNm), ce dernier nécessitant une étape préalable de transcription inverse pour obtenir un ADN complémentaire (ADNc).

Applications de la qPCR

Pour l’ADNg

• Recherche fondamentale : études génétiques des organismes pathogènes, identification de modèles transgéniques.
• Santé publique et alimentaire : détection des organismes génétiquement modifiés (OGM, interdits dans certains contextes), détection et quantification des pathogènes.
• Médecine moléculaire : détermination de la charge virale ou bactérienne, évaluation du grade tumoral, détection de cellules cancéreuses circulantes, quantification de l’ADN tumoral circulant (tcDNA) comme marqueur diagnostique.

Pour l’ARNm

• Recherche : étude de l’expression génique, régulation transcriptionnelle en réponse à un traitement.
• Validation thérapeutique : confirmation de la spécificité tissulaire et du niveau d’expression des gènes cibles, prérequis pour la validation d’une molécule thérapeutique.
• Médecine moléculaire : quantification de la charge virale, mesure de l’expression de marqueurs de résistance tumorale pour évaluer la réponse à la chimiothérapie.

Principe technique de la qPCR

La qPCR repose sur la détection de la fluorescence émise lors de l’amplification de l’ADN. Cette fluorescence est mesurée à chaque cycle, ce qui permet de suivre la progression de la réaction en temps réel.

Fluorescence et courbe sigmoïde

• La fluorescence augmente de façon sigmoïde au fur et à mesure des cycles.
• Le logiciel fixe un <span style="color: #EF4444">seuil de fluorescence</span> (modifiable), au-delà duquel le signal est <span style="color: #EF4444">considéré comme significatif</span>.
• La phase initiale<span style="color: #EF4444"> (1-22 cycles) correspond au bruit de fond.</span>
• La phase exponentielle correspond à une amplification efficace avec un <span style="color: #EF4444">facteur théorique de 2</span> (doublement de l’ADN à chaque cycle).
• <span style="color: #F59E0B">En fin de réaction, la polymérase Taq s’épuise, ce qui fausse la quantification (facteur d’amplification < 2).</span>

Colorants fluorescents

• SYBR Green : se lie au sillon mineur de l’ADN double brin, émettant une fluorescence proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié.
• Ce colorant est universel, se fixe à tout ADN double brin, quelle que soit l’espèce ou le gène.

Interprétation des résultats : le Cycle threshold (Ct)

Le Ct est le nombre de cycles nécessaires pour que la fluorescence dépasse le seuil fixé.

• Plus le Ct est faible, plus la concentration initiale d’ADN ou d’ARNm est élevée.
• Un Ct faible (10-15) indique un gène fortement exprimé.
• Un Ct élevé (30-35) indique une faible expression ou une faible quantité d’ADN.
• Les contrôles endogènes (gènes de référence) ont généralement des Ct plus bas.

La qualité des résultats dépend de :

• La quantité initiale de matériel génétique.
• La qualité des amorces (primers).
• La qualité de l’enzyme de transcription inverse (pour l’ARNm).

Importance des amorces et contrôle de la spécificité

Types d’amorces

• Random hexamers : amorces aléatoires couvrant tout l’ARN.
• Oligo(dT) : amorces spécifiques à la queue polyA des ARNm.
• Amorces spécifiques : ciblent une région précise d’un gène.

Contrôles et calibrations

• Utilisation de dilutions en cascade pour établir une gamme d’étalonnage.
• La courbe Ct vs log(concentration) doit être linéaire avec un coefficient de corrélation > 0,99.
• L’efficacité de la PCR doit être comprise entre 90 % et 110 % (pente de la courbe).

Courbe de fusion (melting curve)

• Permet de vérifier que l’amplification concerne un seul produit spécifique.
• La température de fusion (Tm) correspond au point où 50 % de l’ADN est simple brin et 50 % double brin.
• La présence de plusieurs pics indique plusieurs produits (ex : isoformes, dimères d’amorces).
• La formation de dimères d’amorces nuit à la spécificité et à l’efficacité de la PCR.

Limitations et précautions

• La polymérase Taq s’épuise en fin de réaction, limitant la phase exponentielle.
• Les dimères d’amorces peuvent entrer en compétition avec le produit cible, faussant les résultats.
• Il est nécessaire de changer les amorces si des interactions non spécifiques apparaissent.
• Les fragments amplifiés en qPCR sont courts (50-100 pb) pour limiter les contaminations.

Alternatives et améliorations : la PCR TaqMan

• Utilise une sonde spécifique marquée par un fluorophore et un quencher.
• La sonde est dégradée par la Taq polymérase lors de l’amplification, libérant la fluorescence.
• Plus spécifique et plus sensible que SYBR Green.
• La Ct obtenue est généralement plus élevée qu’avec SYBR Green.
• Pas besoin de courbe de fusion, car la spécificité est assurée par la sonde.
• Coût plus élevé du matériel et des sondes spécifiques.

Résumé des points clés

• La qPCR est une méthode quantitative puissante pour mesurer l’ADN et l’ARNm.
• Le Ct est un indicateur essentiel de la quantité initiale de matériel génétique.
• La qualité des amorces et la spécificité de l’amplification sont cruciales pour des résultats fiables.
• SYBR Green est un colorant universel, tandis que TaqMan offre une plus grande spécificité.
• La courbe de fusion est indispensable pour valider la spécificité avec SYBR Green.
• La qPCR est largement utilisée en recherche, médecine moléculaire, et détection de pathogènes.

Cette technique, bien maîtrisée, permet d’obtenir des données précises sur l’expression génique, la charge virale, ou la présence de mutations, avec des applications cliniques et scientifiques majeures.